Domande e Risposte


  1. Come devo coltivare una linea aderente?
  2. Come devo coltivare una linea in sospensione?
  3. Con che frequenza devo dividere una coltura?
  4. Cosa si intende con il termine passaggio?
  5. Come devo scongelare una linea cellulare?
  6. Posso aggiungere antibiotici alla coltura cellulare?
  7. Devo sempre aggiungere L-glutamina alle colture, anche se non è nella ricetta del terreno di coltura?
  8. Posso coltivare la linea in un terreno diverso da quello indicato da ICLC?
  9. Posso conservare le linee cellulari a -80°C?
  10. Qual è il modo più corretto per congelare una linea cellulare, in assenza di un congelatore programmabile?
  11. Qual è la percentuale di linee cellulari contaminate da micoplasma in circolazione?
  12. Come posso individuare una contaminazione da micoplasma?
  13. Quali test per la contaminazione da micoplasma sono affidabili?
  14. E' possibile curare una linea contaminata da micoplasma?
  15. Cosa sono la Master Bank (MB) e la Working Bank (WB)?
  16. Quali linee cellulari devo considerare pericolose, e quali precauzioni devo prendere?
  17. Cosa significa operare in Categoria di contenimento 2?

  18. 1. Come devo coltivare una linea aderente?

    Prima di tutto fare riferimento alle indicazioni specifiche presenti nella scheda di sicurezza. In generale le linee aderenti vengono disaggregate con enzimi proteolitici, come la tripsina. L'acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) aumenta l'attività della tripsina rimuovendo calcio e magnesio dalla superficie delle cellule. ICLC usa una soluzione di tripsina 0.05% EDTA 0.02%. Si procede eliminando il terreno (il siero inibisce l'azione della tripsina) e sciacquando con PBS senza calcio e magnesio. Poi si aggiungono 0.5 - 2 ml di tripsina/EDTA (a seconda della grandezza della fiasca) e si mette la fiasca in incubatore a 37°C per 3 - 5 minuti. Si verifica al microscopio che le cellule si siano staccate e si dà un colpetto alla fiasca per staccarle completamente. Si aggiunge terreno di coltura con siero (che inibisce l'attività della tripsina). Si risospendono bene le cellule e si dividono (split) tenendo conto delle caratteristiche di crescita della linea e delle necessità di espansione. E' consigliabile non scendere mai al di sotto della densità di 1 x 104 cellule / cm2 nella nuova fiasca.

    2. Come devo coltivare una linea in sospensione?

    Alle colture in sospensione si può aggiungere il terreno fresco direttamente nella fiasca, fino ad un massimo di 15 ml, 50 ml e 100 ml rispettivamente per fiasche da 25, 75 e 150 cm2 , e quando le cellule raggiungono la concentrazione di saturazione (tra 3 x 105 e 2 x 106) si dividono in due o più fiasche; è necessario diluirle per riportarle ad una crescita logaritmica, e non è quindi sufficiente cambiare il terreno a una coltura ad alta densità, che smetterà di crescere e morirà rapidamente. E' conveniente contare spesso le cellule di una linea che si coltiva per la prima volta, per mantenerla sempre all'interno delle concentrazioni consigliate, e comunque non scendere mai al di sotto della densità minima di di 1 x 105 cellule / ml.

    3. Con che frequenza devo dividere una coltura?

    Il termine divisione (subculture) è sinonimo di passaggio e split. La frequenza dipende dalla linea: fare riferimento alle indicazioni specifiche presenti nella scheda di sicurezza. In generale si divide una coltura a confluenza o vicina alla confluenza, cioè alla formazione di un monostrato di cellule aderenti l'una all'altra. Alcune linee non arrivano a confluenza, crescono in ammassi tridimensionali, e devono essere divise quando hanno raggiunto la densità massima per quella particolare linea. ICLC segnala le caratteristiche di crescita particolari delle linee. Le linee che mantengono la inibizione da contatto dovrebbero essere divise prima di arrivare alla confluenza, per evitare la selezione di varianti non inibite dal contatto. Le linee in sospensione devono essere divise,in generale, quando le cellule raggiungono la concentrazione di saturazione (tra 3 x 105 e 2 x 106); è necessario diluirle per riportarle ad una crescita logaritmica, e non è quindi sufficente cambiare il terreno a una coltura ad alta densità, che smetterà di crescere e morirà rapidamente. Se le cellule sono diluite al di sotto della concentrazione consigliata, cresceranno molto lentamente o moriranno.

    4. Cosa si intende con il termine passaggio?

    ICLC indica il passaggio delle linee cellulari aderenti quando questo dato è disponibile. Il termine passaggio è sinonimo di divisione e split: quindi una linea ha 35 passaggi quando le cellule, a partire da quando la linea è stata messa in coltura la prima volta, sono state trasferite 35 volte da una fiasca ad un'altra. Altra cosa è il tempo di duplicazione, che varia da linea a linea, da 18 ore a 7 giorni. Linee con tempo di duplicazione più basso saranno splittate più spesso, ma le duplicazioni coincideranno con i passaggi solo se lo split sarà sempre 1:2.

    5. Come devo scongelare una linea cellulare?

    La regola è: congelare rapidamente, scongelare dolcemente. Quando si estrae l'ampollina dai vapori d'azoto o dal ghiaccio secco, dopo aver controllato che la scritta sull'ampolla corrisponda alla linea che si vuole scongelare, lasciarla un paio di minuti a temperatura ambiente, quindi immergerla in un bagno a 37°C, agitando dolcemente, in modo che solo la parte inferiore dell'ampolla sia a contatto con l'acqua. Quando il liquido si è sciolto quasi completamente, e solo una pallina di ghiaccio rimane al centro dell'ampolla, estrarla dal bagno e pulirla con alcool etilico 70%. Quindi, sotto cappa a flusso laminare, aprire l'ampolla. Con una pipetta da 2 ml aggiungere lentamente al contenuto dell'ampolla 0.3 - 0.4 ml di terreno, quindi estrarre il contenuto ed aggiungerlo lentamente ad una provetta contenente 10 ml di terreno. Se la linea cresce in sospensione, per eliminare il DMSO centrifugare 10 minuti a 1000 rpm, eliminare il sopranatante e risospendere le cellule nel volume finale, in fiaschina da 25 cm2. Se la linea cresce aderente non è necessario centrifugare, si può mettere la linea in coltura e cambiare il terreno dopo che le cellule si sono attaccate.

    6. Posso aggiungere antibiotici alla coltura cellulare?

    E' consigliabile coltivare le cellule in assenza di antibiotici, per diverse ragioni: gli antibiotici inibiscono la crescita e sono moderatamente tossici per le cellule; l'aggiunta di antibiotici permette di non lavorare secondo le più rigide regole di sterilità e quindi favorisce la contaminazione da micoplasma; una contaminazione batterica può non diventare immediatamente evidente ma rimanere latente; gli antibiotici nel terreno aumentano la percentuale di falsi negativi nei test per individuare la presenza di micoplasma. ICLC non usa antibiotici per espandere le linee, ma li aggiunge quando le spedisce in coltura, perchè in molti laboratori si aggiungono regolarmente antibiotici alle colture.

    7. Devo sempre aggiungere L-glutamina alle colture, anche se non è nella ricetta del terreno di coltura?

    La L-glutamina è un aminoacido essenziale, richiesto da tutte le linee di mammifero e di invertebrato. L'unico motivo per cui non viene sempre inclusa nelle formulazioni dei terreni di coltura è la sua relativa instabilità, che diminuirebbe la durata del terreno. Per questo viene aggiunta al momento dell'uso. Se un terreno viene usato molto tempo dopo essere stato preparato, è conveniente aggiungere nuovamente la L-glutamina. Nella maggior parte dei terreni la concentrazione corretta di L-glutamina è 2mM, ma può variare, e in questo caso l'informazione viene fornita da ICLC nelle condizioni di coltura della linea.

    8. Posso coltivare la linea in un terreno diverso da quello indicato da ICLC?

    In generale ICLC indica nel catalogo il terreno di coltura segnalato dal depositante, o un altro terreno che si è rivelato adatto alla crescita della linea cellulare. Altri terreni possono essere altrettanto adatti, ma è consigliabile adattare lentamente la linea al nuovo terreno. Una buona tecnica è quella di congelare alcune ampolle di riserva con il terreno originale, poi preparare due fiaschine: una viene divisa con terreno originale, l'altra con terreno originale 50% e terreno nuovo 50%. Se non si nota alcun danno alle cellule, si può procedere fino ad avere il 100% di terreno nuovo. Se non si ha a disposizione il terreno consigliato, è meglio acquistare la linea in coltura e utilizzare il terreno che riempie la fiaschina per adattare la linea al nuovo terreno.

    9. Posso conservare le linee cellulari a -80°C?

    Solo per periodi brevi, e in ogni caso per non più di 3 mesi, nella parte del congelatore più protetta dalle variazioni di temperatura prodotte dall'apertura della porta. La perdita di vitalità varia da linea a linea, ma per alcune linee è quasi totale dopo soli 4 mesi. Se la linea cellulare non viene usata al ricevimento, deve essere conservata sotto i -135°C, meglio se in vapori di azoto liquido. Linee conservate in questo modo sono state scongelate dopo più di trent'anni, senza significativa diminuzione della vitalità.

    10. Qual è il modo più corretto per congelare una linea cellulare, in assenza di un congelatore programmabile?

    La variazione di temperatura ideale per congelare una coltura cellulare è di -1°C / minuto. Esistono apposite scatole per congelamento lento, che introdotte in un congelatore a -80°C permettono di congelare con successo. Anche una scatola in polistirolo con pareti e coperchio dello spessore di 15-20 mm funziona in modo soddisfacente.

    11. Qual è la percentuale di linee cellulari contaminate da micoplasma in circolazione?

    E' molto più alta di quanto si possa immaginare. ICLC ha testato per micoplasma negli ultimi 4 anni quasi 300 linee cellulari per inserirle nel catalogo, e di queste più della metà sono risultate contaminate. Solo un controllo continuo e accurato di tutte le proprie linee può garantire di operare con materiale di qualità.

    12. Come posso individuare una contaminazione da micoplasma?

    Solo con test appropriati: il micoplasma non è visibile ai normali microscopi (ha un diametro di circa 0.2 um), e gli effetti che la contaminazione può produrre in una coltura sono estremamente vari. Spesso non vi è nessun danno evidente e la linea cresce bene, altre volte il monostrato presenta delle lacune o si solleva a lembi, il terreno può cambiare pH e diventare viola o giallo, le funzioni della linea possono essere pesantemente modificate. E' essenziale sapere se le proprie linee sono contaminate da micoplasma, e quando si individua una contaminazione sostituirle. Solo in casi eccezionali (coltura non sostituibile) è consigliabile tentare di curare le cellule, perchè il trattamento è lungo, costoso e il risultato non è garantito.

    13. Quali test per la contaminazione da micoplasma sono affidabili?

    Nessun test, da solo, garantisce l'affidabilità del risultato. E' necessario affiancare almeno due test, diretto e indiretto. ICLC utilizza il test in fluorescenza con Hoechst 33258 e la nested PCR. Altre banche utilizzano il test colturale, che permette di individuare, con terreni specifici, le colonie di micoplasma. Se non si è mai utilizzato alcun test, la fluorescenza è il più adatto per un primo screening di tutte le colture: è rapido, economico e di facile esecuzione. E' importante poi controllare le colture ad ogni congelamento, e quindi congelare molte ampolle insieme.

    14. E' possibile curare una linea contaminata da micoplasma?

    Sì, alcune delle linee del catalogo ICLC sono state curate. Il trattamento è un processo lungo e costoso, e il successo non è garantito. Ogni volta che è possibile, è preferibile eliminare la coltura e scongelare un'altra ampolla. ICLC utilizza per il trattamento BM-ciclina o MRA, con cicli di trattamento diversi per i diversi antibiotici. In ogni caso è necessario monitorare il trattamento con test in fluorescenza e PCR, e dopo la fine del trattamento la linea cellulare deve essere tenuta in osservazione per un periodo non inferiore a un mese.

    15. Cosa sono la Master Bank (MB) e la Working Bank (WB)?

    Il concetto di MB e WB è ormai entrato nell'uso comune nelle aziende, dove la produzione di materiali biologici è organizzata secondo le regole della GLP e della GMP. Non tutti i laboratori però utilizzano questo semplice metodo di controllo della qualità delle loro cellule. Appena si riceve una linea cellulare, in coltura o congelata, dopo un primo screening si espande e si congela la MB (da 3 a 10 ampolle). Nel frattempo si fa un controllo di qualità (QC) più accurato, e in ogni caso un ulteriore test per micoplasma prima del congelamento. Quando il QC è completato si scongela un'ampolla della MB, si verifica la vitalità allo scongelamento e si espande ulteriormente la linea fino ad ottenere la WB (da 10 a 30 ampolle). Anche in questo caso si effettua un ulteriore test per micoplasma prima del congelamento. Solo la WB sarà utilizzata per gli esperimenti, e una nuova ampolla della MB sarà scongelata quando resteranno solo 2 o 3 ampolle della WB. In questo modo si potrà operare per lunghi periodi con una linea sempre uguale a se stessa, libera da contaminazioni e a passaggi bassi.

    16. Quali linee cellulari devo considerare pericolose, e quali precauzioni devo prendere?

    Non è possibile testare ogni linea cellulare per ogni possibile agente contaminante. Le linee umane e di primate derivate da tessuto linfoide o tumorale, indipendentemente dalla presenza accertata di sequenze virali, dovrebbero essere coltivate tutte allo stesso livello di biosicurezza di linee infettate da virus. Lo stesso vale per i tessuti e i fluidi umani, per le linee di primate contenenti virus, per le linee contaminate da micoplasma.

    17. Cosa significa operare in Categoria di contenimento 2?

    Precauzioni per la Categoria di contenimento 1:
    a. Limitare l'accesso al laboratorio al personale addestrato.
    b. Decontaminare le superfici di lavoro prima e dopo ogni attività.
    c. Usare pipettatori meccanici.
    d. Non mangiare, bere o fumare in laboratorio.
    e. Usare il camice esclusivamente in laboratorio.
    f. Lavare le mani prima e dopo aver lavorato con le cellule.
    g. Usare una cappa a flusso laminare.

    Ulteriori precauzioni per la Categoria di contenimento 2:
    a. Usare una cappa a flusso laminare verticale per tutte le manipolazioni cellulari che possono creare aerosol, indipendentemente dalla necessità di operare in sterilità.
    b. Mettere il materiale contaminato in un biobox (contenitore per rifiuti biologici).
    c. Usare guanti monouso.

    Precauzioni minime consigliate: uso di guanti e camici monouso, pipettatori meccanici o elettrici, cappa a flusso laminare verticale, decontaminazione di rifiuti liquidi e solidi prima dell'eliminazione nei biobox.