Controlli di qualita': micoplasma


Ogni linea che accede alla Banca Biologica segue una precisa procedura. Al momento dell'arrivo le viene assegnato un codice, e tutti i dati disponibili vengono inseriti nella banca dati. Sulla base delle indicazioni fornite dall'originatore (terreno di coltura e supplementi, concentrazione ottimale di cellule), un'ampolla viene scongelata e messa in coltura, si valuta la vitalità allo scongelamento e si controllano al microscopio morfologia ed eventuali contaminazioni evidenti.
Ha quindi inizio il controllo di qualità, i cui risultati vanno ad aggiornare la banca dati. Durante questa fase la linea viene coltivata in una stanza di quarantena, riservata alle linee la cui sterilità non è ancora stata accertata. Per rendere immediatamente evidente un'eventuale contaminazione, le linee vengono coltivate sempre in assenza di antibiotici.
Per la verifica di un'eventuale contaminazione da micoplasma vengono effettuati almeno due diversi test, in fluorescenza e con PCR, e nei casi dubbi anche un terzo test biochimico. Quando i controlli sono terminati, la linea viene espansa, congelata e inserita nel catalogo.

Test per micoplasma in fluorescenza

La colorazione del DNA con fluorocromi é un test molto rapido e semplice, permette di individuare tutti i ceppi di micoplasma ma é poco sensibile e le colture poco contaminate possono risultare negative. Per il test in fluorescenza con bisbenzimide (Hoechst 33258, un fluorocromo specifico per il DNA) si preparano due piastre di Petri con le cellule. Una delle piastre viene analizzata dopo 24 ore, l'altra dopo tre giorni. Se la coltura è negativa appaiono fluorescenti solo i nuclei; se la coltura è positiva le cellule appariranno circondate da piccole formazioni fluorescenti, sferiche o filamentose, a grappolo, in fila o isolate.

Test per micoplasma con PCR

Le linee che risultano negative al test in fluorescenza vengono analizzate con PCR. I vantaggi principali di questa metodica sono la grande sensibilità, la specificità, la rapidità e la semplicità di esecuzione. Il metodo prevede l'utilizzo di un pool di oligonucleotidi (TIB Molbiol) capaci di riconoscere sequenze specifiche di 25 diverse specie di micoplasma, tra cui le cinque specie più spesso responsabili di contaminazione di colture cellulari (M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis, M. orale e Acholeplasma laidlawii). Le linee che risultano negative anche a questo secondo controllo di sterilità vengono congelate (2 - 4 ampolle di riserva) per la successiva espansione.

Test biochimico per micoplasma

Un terzo test per l'individuazione di contaminazioni da micoplasma è il Mycotect (Gibco BRL). Questo test si basa su una differenza biochimica tra cellule di mammifero e micoplasmi per quanto riguarda la produzione dell'enzima adenosina fosforilasi, presente in grande quantità nei micoplasmi e solo in tracce nelle cellule di mammifero.

Eradicazione del micoplasma

Il trattamento con antibiotici é il metodo più semplice ed efficace per l'eliminazione del micoplasma dalle colture contaminate anche se, quando possibile, é sicuramente preferibile la sostituzione della coltura contaminata. Infatti la metodica é lunga e costosa, ha effetti collaterali notevoli (citotossicità) e richiede un lungo monitoraggio delle colture per escludere una contaminazione residua. Gli antibiotici più efficaci sono l'MRA (Mycoplasma Removal Agent, un fluorochinolone inibitore della DNA girasi), la ciprofloxacina e la BM ciclina, da usare per periodi limitati su linee contaminate e non come misura preventiva per evitare la contaminazione.